Le NAS exploite la capacité unique des nanopores d'Oxford Nanopore Technologies (ONT) à contrôler le flux directionnel de l'ADN en cours de séquençage par modulation de la polarité du courant appliqué. La technologie combine l'identification en temps réel des bases séquencées avec un alignement dynamique sur un ensemble de séquences de référence fournies par l'utilisateur. Lorsque les premières centaines de bases d'un brin d'ADN correspondent aux régions cibles définies, le séquençage complet est maintenu ; dans le cas contraire, le brin est éjecté du pore, libérant immédiatement la capacité de séquençage pour d'autres molécules d'intérêt.

Cette approche révolutionnaire ne nécessite qu'une préparation standard de librairies, éliminant les étapes d'amplification PCR, de synthèse de sondes ou de conception expérimentale complexe. Le processus d'enrichissement sélectif s'effectue en temps réel durant la run de séquençage, offrant une flexibilité et une efficacité inégalées pour l'étude de régions génomiques spécifiques.

Avantages

• Contrairement aux approches de séquençage ciblé traditionnelles (capture par hybridation, amplification PCR longue portée, ou approches Cas9), le NAS ne requiert aucune étape d'enrichissement préalable. La préparation standard de librairies ONT suffit, réduisant considérablement les temps de manipulation et les risques de biais expérimentaux.
• La définition des régions cibles s'effectue par simple fourniture d'un fichier de coordonnées et d'un génome de référence, permettant une adaptation rapide à de nouveaux projets ou l'ajustement en cours d'expérimentation. Cette flexibilité contraste avec la rigidité des panels de sondes pré-synthétisées.
• La combinaison des lectures longues ONT avec l'enrichissement sélectif permet de résoudre des structures génomiques inaccessibles aux technologies courtes (assemblages fragmentés, résolution ambiguë de duplications en tandem, caractérisation précise d'inversions ou translocations).
• L'enrichissement significatif (facteur 4 à 70 selon les métriques) permet de réduire drastiquement les coûts de séquençage par rapport à une approche génome entier, tout en conservant la puissance analytique des lectures longues pour les régions d'intérêt.

Limitations et Considérations Techniques

• Dépendance au génome de référence : L'efficacité du NAS repose sur la disponibilité d'un génome de référence de haute qualité représentatif de l'espèce étudiée. Pour les espèces présentant une forte diversité structurale, l'utilisation de références multiples ou de pangénomes peut s'avérer nécessaire.
• Gamme de tailles optimales : L'enrichissement est optimal pour des régions représentant 1-2% du génome total. Pour les espèces à génome de grande taille ou les familles multigéniques très étendues, une stratégie de sous-échantillonnage des régions cibles peut être requise.
• Gestion des éléments répétitifs : La présence importante d'éléments transposables dans les régions cibles peut nécessiter un masquage préalable pour optimiser la spécificité de l'enrichissement, particulièrement dans les génomes de plantes où ces éléments sont abondants.

_{Profondeur de séquençage NAS sur trois régions cibles représentatives de tailles différentes. (A) Profondeur de séquençage NAS sur les trois régions cibles comparée au reste du chromosome. Les régions cibles (ROI + tampon de 20 kb) sont représentées entre des barres noires en pointillés, tandis que les ROI sont réduites et représentées entre des barres noires pleines. (B) Profondeur de séquençage NAS sur la ROI de la région 01 du chromosome 1 (≈ 173 kb). (C) Profondeur de séquençage NAS sur la ROI de la région 08 du chromosome 5 (≈ 998 kb). (D) Profondeur de séquençage NAS sur la ROI de la région 12 du chromosome 8 (≈ 1 kb). La région 08 contient le cluster Vat, bien étudié. Pour les régions B, C et D, les barres verticales colorées représentent les régions enrichies, tandis que les barres verticales blanches représentent les éléments répétitifs masqués.}

Les résultats du projet NLRome illustrent parfaitement les capacités du NAS et l'expertise développée à l'EPGV. Après une première évaluation dans le projet NLRADAPTSEQ,un enrichissement  efficace et l'assemblage précis des 15 clusters NLR présents dans le génome du melon (représentant environ 1,4% du génome total) a été démontré. L'expérience a révélé un enrichissement moyen de facteur 4 par rapport au séquençage WGS, avec une reconstruction fidèle des structures complexes du cluster Vat (un cluster de gène bien documenté), validée par PCR et comparaison avec des séquences de référence Sanger (Belinchon et al. 2025). Cette validation expérimentale a confirmé la robustesse de la méthode pour trois cultivars génétiquement distants (Anso77, Doublon, et Chang-Bougi), démontrant l'applicabilité du NAS même lorsque la référence diffère significativement des échantillons analysés.
L'approche développée sur le melon constitue un modèle méthodologique transférable à de nombreuses espèces d'intérêt agronomique, ouvrant des perspectives importantes pour l'amélioration des plantes cultivées dans un contexte de transition agroécologique où la diversité génétique des résistances constitue un enjeu majeur.